Imunohistochimia (IHC) și biologia moleculară în medicina oncologică de precizie

Introducere: Testarea imunohistochimică, alături de testările genetice specifice, vin în sprijinul pacientului oncologic în vederea individualizării terapiei. Progresele terapeutice în managementul cancerului din ultimii ani au condus la dezvoltarea unor molecule noi, administrate țintit în funcție de profilul imunohistochimic și molecular al pacientului, astfel că evaluarea și caracterizarea markerilor tumorali sunt instrumente extrem de importante ale medicinei oncologice de precizie.

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în patologia mamară

Imunohistochimia (IHC) joacă un rol important în diagnosticul patologiei mamare, ajutând, în primă instanță, în diferențierea leziunilor tumorale de cele non-tumorale, astfel încât, în laboratorul nostru, utilizăm teste imunohistochimice, pentru:

 – diferențiere leziune primară/secundară (GATA3, GCDFP-15, Mammaglobin, receptori hormonali) + panel-uri specifice unor leziuni neoplazice sau situsuri primare extramamare;

 – discriminarea leziunilor neoplazice primare mamare, benigne/maligne (CK5/6, P63, CD10 – markeri mioepiteliali, receptori hormonali);

 – diagnostic diferențial între neoplaziile in situ (carcinom ductal în situ/neoplazie lobulara – E-Cadherin, Beta-catenin) și cele invazive, prin evaluarea prezenței celulelor mioepiteliale (CK5/6, p63, SMA etc);

 – încadrarea histopatologică (în subtipuri speciale) a neoplaziilor invazive mamare (Chromogranin A, Synaptophyșin, CD56, WT1, E-cadherin, androgen receptor, Beta-catenin; CK5/6, p63, CK 8/18, CK19, CD10, SMA – în carcinoame metaplastice);

 – evaluarea unor factori prognostici și predictivi (receptori hormonali (ER, PR), HER2, Ki67), în funcție de care, leziunile invazive, se clașifică în subtipuri surogat moleculare (LUMINAL);

 – identificarea carcinoamelor mamare invazive, triplu negative (ER-, PR-, HER2-), în mare parte superpozabile celor “basal-like” (la evaluarea profilului molecular/genetic), cu poșibilitate, în curand, de evaluare PD-L1 (clona DAKO 22C3).

            Testele imunohistochimice se efectuează pe platforme automatizate Ventana Benchmark și DAKO Autostainer Link 48.

            Testările genetice în cancerul mamar se efectuează cu scop terapeutic, prognostic sau identificare a predispoziției genetice pentru cancerul mamar.

Sunt 2 tipuri de testări genetice în funcție de proba analizată:

1. Testări genetice somatice – din țesutul tumoral;
2. Testări genetice germinale – din sângele periferic și care au scopul de a identifica mutațiile ereditare asociate riscului de a dezvolta cancer de sân.

Testările genetice în cancerul de sân care se pot efectua în Clinica Sante sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Analiza	Metodologie	Scopul testării
Cancerul de sân – testare BRCA1, BRCA2 Somatic (din tesut tumoral)	Secvențiere NGS	Personalizarea terapiei ·      Mutațiile BRCA1 și BRCA2 sunt mutații acționabile – pe baza rezultatelor se stabilește eligibilitatea la terapia țintită cu inhibitori PARP (PARPi)
FISH HER2	FISH – amplificarea genei HER2	Terapie personalizată anti-HER 2 Marker de agreșivitate, indicativ pentru prognostic nefavorabil dacă terapia antiHER2 nu este administrată
PROșiGNA PAM 50	Cantitativ RT-PCR Testare ce identifică și cuantificăexpreșie a 50 gene implicate în tumorigeneza sânului	Test genetic de prognostic în cancerul mamar Are la bază un algoritm ce permite startificarea riscului (scăzut, intermediar, ridicat): ·      stabilirea riscului de recurență la 10 ani ·      identificarea pacienților pentru care este benefică chimioterapia adjuvantă Identifică subtipul molecular de cancer (4 subtipuri: luminal A-luminal B-Her2 supraexprimat-basal-like) Criterii de testare: ·      diagnostic de cancer în stadiu incipient ·      cu sau fără implicarea ganglionilor limfatici (N1-N3 sau N0) ·      status HER2 negativ, HR pozitivi
BRCA1, BRCA2 Plus – testare germinală (din sânge periferic)	Secvențiere NGS și detecție CNV	Identificarea sindromului de cancer sân și ovar familial (ereditar) – HBOC (hereditary breast ovarian cancer syndrome) ·      Un rezultat pozitiv este asociat cu un risc crescut de a dezvolta cancer mamar și ovarian, dar și alte tipuri de cancer ·      Analiza se recomandă pacientelor diagnosticate cu cancer mamar la o vârstă tânără (<50 ani), sau care au forma triplu negativă (ER-, PR-, HER2-), pacientelor cu cancer mamar bilateral sau în șituația în care există o agregare familială pentru cancer de sân (rude apropiate: mama, bunica, sora cu acest diagnostic). Analiza se recomandă și bărbaților cu diagnosticul de cancer mamar. ·      BRCA pozitiv la un pacient diagnosticat cu cancer mamar ajută în personalizarea terapiei, managementul chirurgical al tumorii (chirurgie conservatoare versus chirurgie radicalăuni/bilaterala), are valoare prognostică, permite stabilirea unui plan de monitorizare și pentru alte tipuri de cancer la care este predispus genetic pacientul ·      Pacienții cu rezultat pozitiv sunt conșiliați genetic cu privire la riscul de a transmite mutația la urmași.
CentoBreast (testare germinală – din sânge periferic)	Panel 28 gene: secvențiere NGS+ detecție CNV ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CDH1, CHEK2, DICER1, EPCAM, FANCC, MEN1, MLH1, MRE11, MSH2, MSH6, MUTYH, NBN, PALB2, PMS2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, RECQL, SMARCA4, STK11, TP53, XRCC2	Testare extinsă ce permite stabilirea riscului de a dezvolta cancer de sân, analizând pe lângă genele BRCA1 și BRCA 2 și alte gene de risc. ·      Analiza se recomandă în aceleași șituații ca și testarea BRCA1 și BRCA2 Plus ·      Rezultatul are scop identificarea mutațiilor patogene asociate cancerului de sân. ·      Pentru rezultatele poșitive se recomandă sfat genetic cu privire la riscul de a transmite mutația la urmași și identificarea altor rude potențial purtătoare de mutație cu risc oncogenic

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în dermatopatologia tumorală

Clinica Sante dispune de teste imunohistochimice pentru diagnosticarea majorității patologiilor tumorale dermatologice.

Testele imunohistochimice disponibile, strict corelate cu aspectul histopatologic din colorația uzualăhematoxilină-eozină și interpretate in context clinic și dermatoscopic adecvat, ajută la depistarea proliferărilor tumorale, determinarea țesuturilor de origine și clasificarea acestora.

La nivelul pielii, vorbim despre tumori epiteliale, melanocitare, mezenchimale, limfoide și determinări secundare de la nivelul pielii sau de la nivelul altor sisteme și organe.

În tumorile melanocitare benigne, maligne sau cu potențial malign incert, se folosesc markeri pentru confirmare și clasificare (MelanA, HMB45, S100, p16, Ki67).

În tumorile epiteliale, se folosesc markeri pentru confirmare, determinarea celulelor de origine și încadrare tumorală (tumori de celule scuamoase – p63, p40, CK5/6, EMA; tumori de celule bazale BerEP4, CD10, CK34betaE12, BCL2; tumori din celulele neuroendocrine – CK20, panCK-AE1/AE3, Chromogranin, Synaptophyșin, CD56; tumori de anexe cutanate (glande sebacee, glande sudoripare, fir de păr) – mCEA, S100, p63, AR, CK7, CD34).

Tumorile mezenchimale necesită în special markeri pentru determinarea celulelor de origine și clasificareaacestora, dar și etiologia tumorii (tumori adipocitare – S100, p16; tumori musculare – SMA, Desmin, MyoD1; tumori vasculare – CD34, CD31, D2-40, HHV8; tumori de teacă nervoasă -S100, tumori fibroase, fibro-histiocitare, miofibroblastice – CD34, SMA, Desmin, CD10, CD68, CD99).

Tumorile/pseudotumorile limfoide cutanate necesită expertiză într-un centru de hematopatologie și teste imunohistochimice specifice, care se pot realiza prin intermediul clinicii noastre – serviciu externalizat contracost, fără decontare prin casa de asigurări.

Testele genetice utile în dermatopatologia tumorală

Testările genetice din țesutul tumoral identifică mutații somatice, mutații care apar strict la nivel tumorii și au scop terapeutic și prognostic. Aproximativ 50-60% din melanoame prezintă mutații la nivelul genei BRAF. Terapia țintintă anti-BRAF a revoluționat managementul melanoamelor metastatice BRAF-V600 pozitive.

Alte mutații somatice oncogenice în melanomul cutanat sunt în gena NRAS ai KIT.

În Clinica Sante, pot fi efectuate aceste testări:

Analiza	Metodologie	Scopul testării și scurtădescriere
Detecția mutațiilor în gena BRAFîn melanom (5 mutații în codonul 600: V600E/K/D/R/M) (țesut inclus în parafină)	Real time PCR	Decizie terapeutică – eligibilitate la terapia țintită
Detecția mutațiilor în gena N RAS, exonii 2, 3 și 4 (codonii 12, 13, 59, 61, 117 și 146) în melanom – 14 mutații (țesut inclus în parafină)	Real time PCR	Factor de prognostic și strategie terapeutică Mutații în exonul 3 sunt asociate cu prognostic nefavorabil.
Panel genetic somatic melanom [MELA]	Secvențiere NGS 3 gene:  BRAF – NRAS – CKIT	Suplimentar, acest panel cuprinde gena KIT. Mutațiile KIT sunt identificate mai frecvent în melanoamele acrolentiginoase. Trialuri clinice în desfășurare pentru eficacitatea terapiei cu inhibitori KIT.

 În melanomul uveal, dispunem de testarea FISH pentru statusul cromozomului 3, monosomia 3 fiind asociatăcu prognostic nefavorabil și potențial metastatic.

Analiza	Metodologie	indicatie
cromozom 3 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH	Melanom uveal

Un grup mic de pacienți sunt predispuși genetic la tumori de piele. Cele mai comune șindroamele genetice asociate cu cancerul de piele:

1. Melanomul malign ereditar care este sugerat pe baza unor criterii:

– diagnostic de melanom la vârsta < 50 ani

– melanoame primare multiple

– istoric oncologic personal și pentru alte tipuri de cancer cu localizare extracutanată

– istoric familial pozitiv (rude de gradull I și II afectate) pentru melanom sau alte tipuri de cancer (cancer de sân, ovar, pancreas, prostată, colon)

2. sindroame asociate cu carcinomul bazocelular: șindrom Gorlin–Goltz, șindrom Rombo, șindromBazex-Dupré-Christol.
3. șindroame asociate cu carcinomul spinocelular: Xeroderma Pigmentosum, sindromul keratita-ihtioza-surditate, sindromul Rothmund-Thomson, sindromul Bloom syndrome, Epidermodisplazia veruciforma.

sindroamele asociate cu predispoziție la cancerul de piele pot fi identificate prin analiza mutațiilor germinale (testare din sânge) în cadrul unei testări genetice extinse:

Analiza	Metodologie	Scop
CentoCancer Comprehenșive-Panel genetic extins predispozitie cancer-secventiere NGS și detecție CNV	Secvențiere NGS 110 gene: ABRAXAS1, ACVRL1, AKT1, APC, ATM, AXIN2, BAP1, BARD1, BLM, BMPR1A, BRCA1, BRCA2, BRIP1, BUB1B, CASR, CDC73, CDH1, CDK4, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CEBPA, CHEK2, CTNNA1, DDX41, DICER1, DIS3L2, EGFR, EPCAM, ETV6, EXT1, EXT2, FANCC, FH, FLCN, GALNT12, GATA2, GPC3, GREM1, HNF1A, HNF1B, HOXB13, HRAS, KIF1B, KIT, MAX, MC1R, MEN1, MET, MITF, MLH1, MLH3, MRE11, MSH2, MSH3, MSH6, MUTYH, NBN, NF1, NF2, NTHL1, PALB2, PDGFRA, PHOX2B, PIK3CA, PMS1, PMS2, POLD1, POLE, POT1, PRKAR1A, PRSS1, PTCH1, PTCH2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, RB1, RECQL, REST, RET, RNF43, RPS20, RUNX1, SAMD9L, SDHA, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, SMAD4, SMARCA2, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, STK11, SUFU, TERT, TGFBR2, TMEM127, TP53, TRIP13, TSC1, TSC2, VHL, WRN, WT1, XRCC2, XRCC3	Diagnostic timpuriu și strategie de prevenție prin monitorizare frecventă atât cutanată,cât și extracutanată. Identificarea rudelor la risc Conșiliere genetică Analiza include genele asociate cu melanomul ereditar, dar și alte genodermatoze cu risc oncogenetic

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în patologia pulmonară

Ca în orice altă patologie, în special tumorală, și în patologia pulmonară/pleuro-pulmonară, testele imunohistochimice (utilizând anticorpi specifici) au un rol critic în stabilirea unui diagnostic histopatologic corect, cu implicații majore în ceea ce privește prognosticul și conduita terapeutică, unele putând fi utilizate ca “unelte” de screening.

Trebuie însă avute în vedere limitările imunohistochimiei ca tehnică, atât de medicul anatomopatolog care interpretează rezultatele testării, cât și de medicul curant, dar și de pacient, aici incluzând și variabilitatea inter- și intraobservator a evaluării rezultatelor testelor imunhistochimice, precum și anumite condiții preanalitice necesare obținerii unor rezultate concludente.

Testele imunhistochimice trebuie interpretate de medici anatomopatologi (sau în unele cazuri de tehnicieni instruiți) cu experiență vastă și, bineînțeles, corelate cu aspectele histomorfologice identificate la examenul convențional (colorație hematoxilină-eozină +/- colorații speciale), precum și cu datele clinice și paraclinice.

Dintre avantajele imunohistochimiei, enumerăm: disponibilitatea extinsă, raportul cost-eficiență, rezultate rapide (“turn-around time”) și posibilitatea utilizării unui material tisular redus cantitativ, comparativ cu cel necesar altor tehnici diagnostice.

În patologia pulmonară/pleuro-pulmonară, imunohistochimia este cel mai frecvent utilizată în diagnosticul și caracterizarea imunofenotipică a leziunilor tumorale, cele non-neoplazice putând fi diagnosticate, în cea mai mare parte, printr-un examen histopatologic convențional atent realizat.

Astfel, în laboratorul nostru, se pot efectua teste imunohistochimice pentru:

– stabilirea caracterului primar sau secundar (metastatic) al neoplaziei, prin utilizarea unor panel-uri de anticorpi (ex. GATA3, Mammaglobin, GCDFP-15, receptori hormonali estrogenici și progesteronici pentru originea mamară a leziunii; GATA3, p63, CK7, CK20 pentru origine urotelială – rinichi, vezică urinară; PSA, PSMA pentru origine prostatică; PAX8, WT1, receptori hormonali, calretinin, InhibinA pentru origine la nivelul tractului genital feminin; CDX2, CK20, SATB2 pentru origine colo-rectală);

– stabilirea liniei/liniilor de diferențiere celulară la nivelul leziunii tumorale (epitelială – panel de citokeratine, EMA; mezenchimală – vimentin, CD10, desmin, actina musculară netedă, myogenin; melanocitară – S100, MelanA, HMB45; limfoidă – CD45/LCA, CD20, CD3, CD5, BCL2, BCL6);

– diagnosticul diferențial între adenocarcinomul pulmonar (în special cel cu arhitectură solidă) și carcinomul scuamos/scuamocelular (TTF1, NapșinA, p40, p63, CK5/6), cu precizarea aceasta – carcinoamele scuamoase prezintă un imunoprofil șimilar, indiferent de origine;

– diagnosticul diferențial între neoplaziile pulmonare și mezoteliomul malign (cu origine pleurală) – TTF1, NapșinA, BerEP4, WT1, D2-40, calretinin, GATA3;

– identificarea diferențierii neuroendocrine în neoplaziile pulmonare și încadrarea tumorilor neuroendocrine (ChromograninA, Synaptophyșin, CD56, Ki67, p53);

– confirmarea diagnosticului de carcinom cu celulă mică (“small cell carcinoma”) – prin evaluarea diferențierii neuroendocrine – având în vedere conduita terapeutică complet diferită de cea din carcinoamele non-microcelulare (NSCLC);

– diagnosticul diferențial (în unele cazuri problematice) între carcinomul cu celula mică și neoplazii cu morfologie uneori relativ similară (carcinom scuamos bazaloid – p40, p63, ChromograninA, Synaptophyșin, CD56; limfom – citokeratine, CD45);

– identificarea pacienților cu tumori pulmonare (carcinoame non-microcelulare) eligibili pentru terapii țintite (ex. inhibitori ALK, inhibitori de tirozin-kinază, inhibitori check-point), utilizând teste companion sau complementare (evaluare ALK în adenocarcinoamele pulmonare – clona D5F3 pe platforma automotizată Ventana Benchmark; evaluare PD-L1 – clona SP263 Ventana și, în curand, clona 22C3 DAKO – pe platforma automatizată Dako Autostainer Link 48).

Testările genetice utile în oncologia pulmonară/pleuro-pulmonară au ca scop ghidarea terapiei țintite/personalizate. Analizele genetice disponibile în Clinica Sante în cancerul pulmonar non-microcelular (NSCLC) sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Analiza	Metodologie	Scopul testarii și scurta descriere
Detecția mutațiilor în exonii 18, 19, 20, 21 în gena EGFR în cancerul pulmonar (țesut inclus în parafină)	Real time PCR	Decizie terapeutică Ø  Prezența mutațiilor activatoare permite tratamentul cu TKI (generatia I, II, III) Ø  Analiza include mutația de rezistență la tratamentul EGFR TKI de generația I și II (T790M) Ø  Prezența mutației BRAF (V600X) permite utilizarea inhibitorilor BRAF
Detecția mutațiilor în gena BRAF în cancerul pulmonar (5 mutații în codonul 600: V600E/K/D/R/M) (țesut inclus în parafină)	Real time PCR
Panel genetic somatic cancer plaman [POUM1]	NGS panel 4 gene:EGFR – BRAF – MET – KRAS	Ø  Prezența mutației MET (exon 14) permite utilizarea inhibitorilor MET Ø  Prezența mutației KRAS este asociată cu prognostic nefavorabil Ø  POUM2 – panel extins ce contine markeri potențiali pentru tratamentul cancerului pulmonar fie prin terapie țintită, fie răspuns la imunoterapie
Panel genetic somatic cancer plaman [POUM2]	NGS panel 19 gene: AKT1, ALK , BRAF, DDR2, EGFR, HER2, FGFR1, FGFR2, FGFR3, KIT, KRAS, MAP2K, MET, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, STK11, TP53
ALK FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – rearanjament ALK	Prezența rearajamentului ALK-Terapie țintită TKI, cu eficacitate mult mai mare decât chimioterapia
ROS1 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – rearanjament ROS1	Prezența rearanjamentului ROS1 -terapia țintită ALK TKI
NTRK1 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – rearanjament NTRK1	Prezența rearanjamentelor permite utilizarea TKI
NTRK2 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – rearanjament NTRK2
NTRK3 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – rearanjament NTRK3
FGFR1 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – amplificare FGFR1	Amplificarea FGFR1- candidat pentru terapia anti-angiogenetică (anti-VEGF, anti-VEGFR)
MET FISH tumori solide [MOHC4]	FISH – amplificare MET	Amplicarea MET sau HER2 – marker de rezistență la TKI
HER2 FISH tumori solide[MOHC5]	FISH – amplificare HER2
RET FISH tumori solide[MOHC4]	FISH – rearanjament RET	Prezența rearanjamenului RET permite utilizarea anticorpilor anti-RET
NRG1 FISH tumori solide [MOCH4]	FISH – rearanjament NRG1	Marker potențial pentru o terapie țintită
Panel genetic somatic cancer pulmonar din biopșie lichidă- 12 gene	Secvențiere NGS 12 gene: AKT1, BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MAP2K1, MET, NRAS, PIK3CA, RET, ROS1, TP53	Metoda acceșibilă, minim invazivă ce poate fi aplicată în diferite șituații clinice: -screening cancer și diagnostic în stadii incipiente – monitorizarea longitudinală a progreșiei bolii – recădere – răspunsul la tratament – evaluarea moleculară a bolii minim reziduale (ân asociere cu imagistica și alte date clinice) – poate să înlocuiascătestarea genetică din țesutul tumoral atunci când acesta este insuficient Recent ghidurile recomandăanaliza cfDNA prin NGS pentru a identifica un spectru larg de mutații și nu doar o mutație țintită

Abrevieri:

TKI- inhibitori tirozin-kinaza

cfDNA- ADN liber circulant

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în patologia șistemului digestiv

Clinica Sante dispune de teste imunohistochimice (IHC) pentru diagnosticarea majorității patologiilor tumorale și non-tumorale din întregul sistem digestiv (esofag, stomac, colon, intestin subțire, apendice, tract bilio-pancreatic, ficat).

Testele imunohistochimice (IHC) disponibile, strict corelate cu aspectul histopatologic din colorația uzualăhematoxilina-eozina și interpretate in context clinic și imagistic adecvat, ajută la depistarea proliferarilor tumorale, determinarea originii tumorilor, clasificarea și gradarea acestora, determinarea factorilor de prognostic și tratament.

La nivelul sistemului digestiv, se diagnostichează tumori benigne și maligne de origine epitelială sau mezenchimală, tumori neuroendocrine, tumori limfoide, tumori mixte și determinări secundare (metastaze) cu localizare digestivă – metastaze cu origine în sistemul digestiv sau din afara acestuia.

În patologia tumorală a sistemului digestiv, se folosesc combinații de markeri/anticorpi imunohistochimici (IHC) în funcție de localizarea tumorii investigate și in strictă corelație cu aspectul acesteia în colorația uzuală la examinarea la microscop.

În tumorile sistemului digestiv, se folosesc markeri/anticorpi imunohistochimici (IHC) pentru determinarea originii tumorale (SATB-2, CDX2, HepPar1/HSA), patogeneza tumorilor (MMR/Msi, p53, p16), clasificarea tumorilor (p63, p40, CK5/6, CK7, CK20, CK19, CDX2, SATB-2, EMA/MUC1, DOG-1, c-Kit/CD117, Synaptophyșin, Chromogranin, CD56, S100, SMA, Desmin, CD31, CD34, LCA/CD45, CD20, CD23, CD3, CD5, CD10, BCL-2, BCL-6, samd),  factori prognostici și de tratament (p53, MMR/Msi, Her2, Ki67 +/- PD-L1).

Testele imunohistochimice se efectuează pe platforme automatizate: Ventana Benchmark și Dako Autostainer 48.

Teste genetice utile in tumorile gastrointestinale se împart în:

1. testări genetice efectuate din blocul tumoral, care se recomandă cu scopul de a caracteriza din punct de vedere molecular tumora, cu importanță majoră în strategia terapeutică bazată pe medicina personalizată.
2. testări genetice efectuate din sânge cu scopul de a diagnostica sindroamele genetice asociate cu cancerul de colon ereditar/familial

În prima categorie de teste genetice, principalii markerii moleculari în cancerul colorectal (CRC) cu importanțăîn prognostic și decizia terapeutică sunt: EGFR, RAS (KRAS, NRAS), BRAF, Msi.

Analizele disponibile în Clinica Sante care analizează statusul mutațional în CRC sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Analiza	Metodologie	Scopul testarii și scurta descriere
Detecția mutațiilor în gena KRAS, exonii 2, 3 și 4 (codonii 12, 13, 59, 61, 117 și 146) în cancerul colorectal – 21 mutații (țesut inclus în parafină)	Real time PCR	Decizie terapeutica 40-50% din CRC prezintămutații RAS Tratamentul anti-EGFR (cetuximab/panitumumab) în mCRC este dependent de statusul genelor KRAS și NRAS
Detecția mutațiilor în gena KRAS, exonul 2 (codonii 12 și 13) în cancerul colorectal – 7 mutații (țesut inclus în parafină)	Real time PCR
Detecția mutațiilor in gena NRAS, exonii 2, 3 și 4 (codonii 12, 13, 59, 61, 117 și 146) în cancerul colorectal – 14 mutații (țesut inclus în parafină)	Real time PCR
Detecția mutațiilor în genele ALL RAS, exonii 2, 3 și 4 (codonii 12, 13, 59, 61, 117 și 146) în cancerul colorectal – 35 mutații (tesut inclus în parafină)	Real-time PCR
Detecția mutațiilor în gena BRAF în cancerul colorectal (5 mutații în codonul 600: V600E/K/D/R/M) (țesut inclus în parafină)	Real-time PCR	10% din CRC prezinta mutații BRAF (cea mai frecventă V600E) BRAF V600E- marker de prognostic nefavorabil în mCRC Statusul mutațional BRAF conduce la selectarea unei cure agresive de chimioterapie în prima linie de tratament Terapia țintită anti-BRAF combinată cu terapia anti-EGFR – standardul de tratament al mCRC in a doua și a treia linie de tratament Prezenta mutației BRAF indicator ca sindromulLynch poate fi exclus
Panel genetic somatic cancer colorectal [COLO1]	Secvențiere NGS 3 gene: KRAS-NRAS-BRAF
Panel genetic somatic cancer colorectal [COLO2]	Secvențiere NGS 21 gene: AKT1 – ALK – BRAF – CTNNB1-EGFR – HER2-FBXW7 – FGFR1 – FGFR2 – FGFR3 – KIT – KRAS – MAP2K1- MET – NRAS – PDGFRA – PIK3CA – PTEN -SMAD4 – STK11 – TP53	Acest panel include panelul COLO1, alături de alți markeri moleculari important pentru strategia terapeuticăîn mCRC, dar și markeri moleculari asociați cu rezistența la terapia anti-EGFR și markeri de prognostic în CRC metastatic și localizat. Mutațiile PIK3CA sunt asociate cu prognostic nefavorabil și răspuns slab la terapia anti-EGFR
HER2 FISH tumori solide[MOHC5]	FISH	Amplificarea HER2- marker de rezistență la terapia anti-EGFR
MET FISH tumori solide [MOHC4]	FISH	Amplificarea MET- marker de rezistențăla terapia anti-EGFR, pacientul poate beneficia de terapia anti-MET
RET FISH tumori solide[MOHC4]	FISH	CRC cu rearanjament RET candidat pentru RET TKI.
NTRK2 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH	CRC cu rearanjament NTRK 1, 2 sau 3 – candidat pentru terapia anti-NTRK
NTRK3 FISH tumori solide [MOHC4]	FISH
Instabilitatea microsatelitara (Msi) – 5 markeri- testare somatică	PCR + analiză de fragmente	Instabilitatea microsatelitară (Msi+) este identificată în 15% din CRC sporadic și intotdeauna prezentă în sindromul Lynch. Markerii moleculari pentru  Msi se recomandă atât pentru CRC metastatic, cât și nonmetastatic. Indicații: Pre-screening pentru sindromul Lynch. Factor de prognostic in CRC nonmetastatic: statusul Msi+ marker de prognostic favorabil în absența mutației BRAF. Terapeutic: eligibilitatea la IMUNOTERAPIE (axa PD-1/PDL-1) în mCRC
Solid tumor panel-Panel genetic somatic tumori solide (149 gene – multiorgan)	Analiza geneticăsomatică a tumorilor solide -149 gene: ABL1, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, APC, AR, ARAF, ARID1A, ASXL1, ATM, ATR, ATRX, AXL, BAP1, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CBL, CCND1, CDH1, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CHEK1, CHEK2, CREBBP, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC2, ESR1, EZH2, FANCA, FANCD2, FANCI, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, FOXL2, GATA2, GNA11, GNAQ, GNAS, H3-3A, H3C2, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KDR, KEAP1, KIT, KMT2A, KMT2C, KMT2D, KNSTRN, KRAS, MAGOH, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAPK1, MAX, MDM4, MED12, MEN1, MET, MLH1, MPL, MRE11, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, MYD88, NBN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R1, PMS2, POLE,PPP2R1A, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAC1, RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAF1, RB1, RBM10, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, SETD2, SF3B1, SLX4, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMO, SPOP, SRC, STAT3, STK11, TERT, TOP1, TP53, TSC1, TSC2, TSHR, U2AF1, VHL, XPO1	Caracterizarea moleculară extinsă a tumorii -markeri cu importanță terapeutică șiprognostică   Include gena POLE, TP53, PIK3CA, genele MMR și altele.

Analizele genetice importante în caracterizarea moleculară a cancerului de stomac și de joncțiune gastroesofagiana disponibile în Clinca Sante:

Analiza	Metodologie			Scopul testarii și scurta descriere
HER2 FISH tumori solide[MOHC5]	FISH			Amplificarea HER2- marker pentru terapia țintită anti-HER2în cancerul metastatic de stomac și cancerul gastroesofagian. Tehnica IHC este utilizată de rutină, iar testare FISH este utilizatăpentru o mai mare precizie în cazurile IHC neclare (++)
MET FISH tumori solide [MOHC4]	FISH			Amplificarea MET- candidat pentru terapia anti-MET
NTRK2 FISH tumori solide [MOHC4]		FISH	CRC cu rearanjament NTRK 1, 2 sau 3 – candidat pentru terapia anti-NTRK
NTRK3 FISH tumori solide [MOHC4]		FISH
FGFR1 FISH tumori solide [MOHC4]		FISH
Instabilitatea microsatelitară(Msi) – 5 markeri- testare somatică		PCR + analiza de fragmente	Instabilitatea microsatelitară(Msi+) este identificată în 10% din cazuri și este asociată cu prognostic bun în cancerul de stomac. Indicații: Factor de prognostic Terapeutic: eligibilitatea la IMUNOTERAPIE (axa PD-1/PDL-1) în formele avansate sau metastatice Pre-screening pentru sindromul Lynch (sindrom cu spectru larg de manifestări).

Analizele genetice importante în caracterizarea moleculară a tumorilor stromale gastrointerstinale (GIST) disponibile în Clinica Sante:

Analiza	Metodologie	Scopul testării și scurtă descriere
Panel genetic somatic GIST [GIST]	Secvențiere NGS 3 gene: KIT-PDGFRA-BRAF	85% din GIST localizate prezintămutații KIT (75%) sau mutații PDGFRA (10%) Testarea are valoare diagnostică, prognostică și terapeutică Prognosticul este influențat nu doar de prezența mutațiilor, dar șide localizarea acestora la nivelul genei. Mutații în exonul 11 a genei KIT sunt asociate cu răspuns favorabil la terapie TKI. Mutația exon 9 în gena KIT, prognostic nefavorabil Tumorile GIST wild-type PDGFRA/KIT/BRAF nu răspund la tratamentul cu TKI.

Analizele genetice importante în caracterizarea moleculară a cancerului pancreatic sunt testările care includ mutațiile BRCA1 și BRCA2, precum și instabilitatea microsatelitară (Msi), acestea având scopul ghidarii terapiei țintite.

Pentru că mutațiile BRCA1 și BRCA2 pot fi constituționale, sunt necesare în anumite cazuri selecționate testarea acestora din sânge pentru stabilirea predispoziției la cancerul de sân/ovar/pancreas.

Analiza	Metodologie	Scopul testarii și scurta descriere
BRCA, BRCA2 somatic	Secvențiere NGS	Terapie țintită Mutațiile BRCA1 șiBRCA2 sunt mutații acționabile – pe baza rezultatelor se stabilește eligibilitatea la terapia țintită cu inhibitori PARP (PARPi)
Instabilitatea microsatelitară(Msi) – 5 markeri- testare somatică	PCR + analiza de fragmente	Indicații: Terapeutic: eligibilitatea la IMUNOTERAPIE (axa PD-1/PDL-1) în formele avansate sau metastatice Pre-screening pentru sindromul Lynch (sindrom cu spectru larg de manifestări).
BRCA1, BRCA2 Plus	Secvențiere NGS+ detecție CNV 2 gene: BRCA1, BRCA2	Se indică în cazurile în care existăsuspiciunea unei forme familiale de cancer

Aproximativ 5-10% dintre cancerele gastrointestinale sunt ereditare (moștenite). Cele mai importante sindroame de cancer de colon ereditar sunt sindromul Lynch (numit și Cancerul colorectal non-polipozic familial) și Polipomatoza adenomatoasă familială, dar și alte sindroame sunt descrise: sindrom Cowden, Polipoza asociată MYH, Cancerul gastric difuz ereditar, Polipoza familială juvenilă, sindromul Peutz-Jeghers.

Mutațiile asociate genelor implicate în cancerul gastrointestinal familial pot fi evaluate în cadrul unei analize extinse:

Analiza	Metodologie	Scop
CentoCancer Comprehenșive-Panel genetic extins predispozitie cancer-secventiere NGS și detecție CNV	Secvențiere NGS 110 gene: ABRAXAS1, ACVRL1, AKT1, APC, ATM, AXIN2, BAP1, BARD1, BLM, BMPR1A, BRCA1, BRCA2, BRIP1, BUB1B, CASR, CDC73, CDH1, CDK4, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CEBPA, CHEK2, CTNNA1, DDX41, DICER1, DIS3L2, EGFR, EPCAM, ETV6, EXT1, EXT2, FANCC, FH, FLCN, GALNT12, GATA2, GPC3, GREM1, HNF1A, HNF1B, HOXB13, HRAS, KIF1B, KIT, MAX, MC1R, MEN1, MET, MITF, MLH1, MLH3, MRE11, MSH2, MSH3, MSH6, MUTYH, NBN, NF1, NF2, NTHL1, PALB2, PDGFRA, PHOX2B, PIK3CA, PMS1, PMS2, POLD1, POLE, POT1, PRKAR1A, PRSS1, PTCH1, PTCH2, PTEN, RAD50, RAD51C, RAD51D, RB1, RECQL, REST, RET, RNF43, RPS20, RUNX1, SAMD9L, SDHA, SDHAF2, SDHB, SDHC, SDHD, SMAD4, SMARCA2, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, STK11, SUFU, TERT, TGFBR2, TMEM127, TP53, TRIP13, TSC1, TSC2, VHL, WRN, WT1, XRCC2, XRCC3	Detecție rapidă și strategie de prevenție În funcție de istoricul personal și istoricul oncologic familial, medicul vă poate recomanda aceasta analiză Au fost stabilite ghidurile de management ale pacienților cu risc înalt genetic pentru dezvoltarea cancerului de colon

Abrevieri

CRC- cancer colorectal

mCRC- cancer colorectal metastatic

TKI- inhibitor de tirozin-kinaza

  

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în patologia tractului genital feminin

Clinica Sante dispune de teste imunohistochimice pentru diagnosticarea majorității patologiilor tumorale și non-tumorale din intregul tract genital feminin: anexe (ovare și trompe uterine/salpinge), uter (corp uterin și col uterin/cervix), vagin și vulvă.

Testele imunohistochimice disponibile, strict corelate cu aspectul histopatologic din colorația uzualăhematoxilină-eozină și interpretate în context clinic și imagistic adecvat, ajută la depistarea proliferărilor tumorale, determinarea originii tumorilor, clasificarea și gradarea acestora, determinarea factorilor de prognostic și tratament.

La nivelul tractului genital feminin, se diagnostichează tumori benigne și maligne de origine epitelială sau mezenchimală, tumori mixte, tumori de cordoane sexuale și tumori de celule germinale, determinari secundare cu localizare genitală – metastaze cu origine în tractul genital sau din afara acestuia.

În patologia ginecologică, se folosesc combinații de markeri în funcție de localizarea tumorii investigate microscopic și în stricta corelație cu aspectul acesteia în coloratia uzuală.

În tumorile epiteliale, se folosesc markeri pentru determinarea originii tumorale (PAX 8, ER, PR, p16, mCEA), patogeneză (p16, MMR/Msi, p53), clasificarea tumorilor sau a leziunilor premaligne (WT1, Vimentin, Napșin A, GATA 3, p16, p53, MMR/Msi, p63, p40, CK5/6, CK7, CK20, CDX2),  gradarea lor (p16, p53, Ki67), factori prognostici și de tratament (p53, MMR/Msi, ER, PR, HER2).

În tumorile mezenchimale, se folosesc preponderent markeri necesari clasificării tumorilor și determinarea țesuturilor de origine (Desmin, SMA, MyoD1, S100 , CD10, MelanA, HMB45).

În tumorile de cordoane sexuale și tumori de celule germinale, testele imunohistochimice ajută la încadrarea și clasificarea tumorilor (Calretinin, Inhibin, CD99, CD56, Melan A, WT1, Synaptophyșin, Chromogranin, Thyreoglobulin, PAX8, TTF1).

Determinări secundare – metastaze de la nivelul altor organe sau infiltrări tumorale de la nivelul organelor învecinate.

Testările genetice somatice în tumorile ginecologice au valoare terapeutică și prognostică. Acestea sunt disponibile în Clinica Sante și sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Analiza	Metodologie	Scopul testarii
BRCA1, BRCA2 Somatic (din țesut tumoral)	Secvențiere NGS	Mutațiile BRCA1 și BRCA2 sunt raportate în 6% dintre cancerele ovariene. Scopul testării: personalizarea terapiei ·      Mutațiile BRCA1 și BRCA2 sunt mutații acționabile – pe baza rezultatelor se stabilește eligibilitatea la terapia țintită cu inhibitori PARP (PARPi)
Instabilitatea microsatelitară (Msi) – 5 markeri- testare somatică	Analiza de fragmente	Testare în cancerul ovarian și cancerul endometrial cu scopul: Ø  Pre-screening pentru sindromul Lynch. Markerul molecular pentru cancerul sporadic este hipermetilarea MLH1. Ø  Factor de prognostic: statusul Msi+ clasificare în categoria grupului molecular cu prognostic bun. Ø  Terapeutic: în viitorul apropiat stratificare teranostică utilizând imunoterapia în formele avansate
Solid tumor panel-Panel genetic somatic tumori solide (149 gene – multiorgan)	Analiza genetică somaticăa tumorilor solide -149 gene: ABL1, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, APC, AR, ARAF, ARID1A, ASXL1, ATM, ATR, ATRX, AXL, BAP1, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CBL, CCND1, CDH1, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN1B, CDKN2A, CDKN2B, CHEK1, CHEK2, CREBBP, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC2, ESR1, EZH2, FANCA, FANCD2, FANCI, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FLT3, FOXL2, GATA2, GNA11, GNAQ, GNAS, H3-3A, H3C2, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK1, JAK2, JAK3, KDR, KEAP1, KIT, KMT2A, KMT2C, KMT2D, KNSTRN, KRAS, MAGOH, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAPK1, MAX, MDM4, MED12, MEN1, MET, MLH1, MPL, MRE11, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, MYD88, NBN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NRAS, NTRK1, NTRK2, NTRK3, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3R1, PMS2, POLE, PPP2R1A, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAC1, RAD50, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAF1, RB1, RBM10, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, SETD2, SF3B1, SLX4, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMO, SPOP, SRC, STAT3, STK11, TERT, TOP1, TP53, TSC1, TSC2, TSHR, U2AF1, VHL, XPO1	Caracterizarea moleculară a tumorii   În cancerul endometrial, statusul mutațional gena POLE și gena TP53, alături de statusul MMR permite clasificarea în subgrupuri moleculare de risc – valoare prognostică și terapeutică. Prezenta mutației TP53 este asociată cu un prognostic nefavorabil, în timp ce tumorile cu mutație POLE au un prognostic mai bun.

Testările genetice germinale sunt importante în stabilirea diagnosticului sindroamelor genetice asociate cu risc crescut tumoral în sfera ginecologică, dar și alte tipuri de cancer: sindromul Lynch și sindromului de cancer sân și ovar familial (ereditar) – HBOC (hereditary breast ovarian cancer syndrome).

Analiza	Metodologie
Testare genetică – sindrom Lynch (analiza germinală)	Secvențiere NGS 5 gene MMR: MLH1, MSH2, MSH6, PALB2, PMS2
BRCA1, BRCA2 Plus	Secvențiere NGS+ detecție CNV 2 gene: BRCA1, BRCA2
Panel genetic cancer de sân, ovar și prostată(include BRCA1, BRCA2)- Hereditary Breast/Ovary and Prostate panel (EOSOP)	Secvențiere NGS,15 gene: ATM, BRCA1, BRCA2, CDH1, EPCAM, HOXB13, MLH1, MSH2, MSH6, PALB2, PMS2, PTEN, RAD51C, RAD51D, TP53

*Abrevieri:

ER – receptor estrogen

PR – receptor progesteron

mCEA – antigen carcinoembrionar monoclonal

WT1 – “Wilms Tumor – 1”

MMR (mismatch repair genes)/ Msi – instabilitate microsatelitara

SMA – actina specifica muschiului neted

HMB45 – “human melanoma black”

TTF1 – factorul de transcriptie tiroidian-1

Teste imunohistochimice (IHC) și moleculare în patologia tractului urinar

Clinica Sante dispune de teste imunohistochimice pentru diagnosticarea majorității patologiilor tumorale și non-tumorale din întregul tract urinar (rinichi, vezică urinară, prostată, uretră).

Testele imunohistochimice disponibile, strict corelate cu aspectul histopatologic din colorația uzuală hematoxilină-eozină și interpretate în context clinic și imagistic adecvat, ajută la depistarea proliferărilor tumorale, determinarea originii tumorilor, clasificarea și gradarea acestora, determinarea factorilor de prognostic și tratament.

La nivelul tractului urinar, se diagnostichează tumori benigne și maligne de origine epitelială sau mezenchimală, tumori neuroendocrine, tumori mixte și determinări secundare (metastaze) cu localizare urogenitală – metastaze cu origine în tractul urinar sau din afara acestuia.

În patologia tumorală a tractului urinar, se folosesc combinații de markeri/anticorpi imunohistochimici (IHC) în funcție de localizarea tumorii investigate și în stricta corelație cu aspectul acesteia în colorația uzuală la examinarea la microscop.

În tumorile tractului urinar, se folosesc markeri/anticorpi imunohistochimici (IHC) pentru determinarea originii tumorale (RCC, PAX-8, GATA-3, PSA/PSMA), sau clasificarea tumorilor (p63, CK7, CK20, CD10, c-Kit/CD117, Vimentin, AMACR/P504S, Synaptophyșin, Chromogranin, CD56, S100, SMA, Desmin, CD31, CD34, samd).

Testele imunohistochimice se efectuează pe platforme automatizate: Ventana Benchmark și Dako Autostainer 48.

Testările genetice în cancerul de tract urinar

Numeroase trialuri clinice sunt în desfășurare pentru a identifica eficacitatea imunoterapiei asociată chimioterapiei în cancerul urotelial Msi+ astfel că testarea dMMR/Msi, alături de expreșia PD-1 ar putea avea valoare predictiv pentru răspunsul la imunoterapia țintită PD-1.

În același timp, testarea instabilității microsatelitare poate fi utilizată pentru cancerul urotelial asociat sindromului Lynch (test de screening șindrom Lynch).

Analiza	Metodologie
Instabilitatea microsatelitară (MSI) – 5 markeri – testare somatică	PCR + analiza de fragmente

Sindromul Lynch este cauzat de mutații germinale în genele MMR și este asociat cu un risc semnificativ de a dezvolta în timpul vieții diverse tipuri de cancer: cancer colonic, cancer endometrial, cancer urotelial, cancer de stomac, cancer de ovar, cancer de pancreas, cancer de tract biliar. Pentru diagnosticul sindromului Lynch avem disponibilă analiza:

Analiza	Metodologie
Testare genetică – sindrom Lynch (analiza germinală)	Secvențiere NGS 5 gene MMR: MLH1, MSH2, MSH6, PALB2, PMS2

 

Articolul Imunohistochimia (IHC) și biologia moleculară în medicina oncologică de precizie a apărut prima dată pe Clinica Sante - Laborator de Analize Medicale.